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Título: Validação de parâmetros de mérito para quantificação de microcistina-LR por meio de cromatografia líquida de alta eficiência acoplado a detector de arranjo de diodos
Título(s) alternativo(s): Validation of merit parameters for quantification of microcystin-LR by high performance liquid chromatography coupled with diode array detector
Autor(es): Konzen, Raquel de Almeida
Orientador(es): Coral, Lucila Adriani
Palavras-chave: Análise cromatográfica
Cianobactéria
Cianotoxinas
Chromatographic analysis
Cyanobacteria
Cyanobacterial toxins
Data do documento: 3-Dez-2015
Editor: Universidade Tecnológica Federal do Paraná
Câmpus: Curitiba
Referência: KONZEN, Raquel de Almeida. Validação de parâmetros de mérito para quantificação de microcistina-LR por meio de cromatografia líquida de alta eficiência acoplado a detector de arranjo de diodos. 2015. 77 f. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Química) - Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Curitiba, 2015.
Resumo: Cianobactérias são microrganismos que, quando submetidos a determinadas condições ambientais, podem passar a produzir e liberar diferentes metabólitos, dentre eles as cianotoxinas. Uma cianotoxina hepatotóxica de grande importância é a microcistina-LR (MCLR), de aparecimento comum em florações de cianobactérias do gênero Microcystis, principalmente, e com efeitos severos ao organismo humano e de animais se ingerida. A detecção deste metabólito em água é comumente realizada a partir de técnicas cromatográficas, as quais necessitam de etapas prévias de otimização e validação do método escolhido. O objetivo do estudo foi a otimização e validação de um método cromatográfico para a quantificação da microcistina-LR, e também a análise cromatográfica de extratos de cianobactérias contendo a toxina. Devido à baixa sensibilidade da técnica na detecção deste composto, foram realizados ensaios de recuperação deste analito, através da técnica de extração em fase sólida (SPE). As análises foram conduzidas em um cromatógrafo líquido de alta eficiência com detector de arranjo de diodos (HPLC-DAD) (Agilent - 1260 Infinity). Com base em dados da literatura, o método a ser validado consistiu em uma eluição isocrática utilizando-se como fase móvel (FM) acetonitrila (ACN) com ácido trifluoracético (TFA) 0,05% (Fase A) e água com (TFA) 0,05% (Fase B) e coluna cromatográfica C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 μm). Através da otimização do método, foram definidas como melhores condições de análise o monitoramento em 238 nm, proporção de FM de 60H2O:40ACN, com volume de injeção de 20 µL e vazão de 1,0 mL min-1. Na validação em água ultrapura, foi estabelecido que o método é linear para a faixa de trabalho testada, com um limite de detecção (LD) de 0,06 mg L-1 e um limite de quantificação (LQ) de 0,17 mg L-1. Uma metodologia para concentração da MC-LR também foi estabelecida, através da técnica de extração em fase sólida utilizando-se cartuchos CHROMABOND® C-18 end-capped, sendo que recuperações de 98,51 ± 2,74% foram obtidas. Testes envolvendo extratos obtidos a partir de cultivo de cianobactérias, preparados em estudos anteriores, também foram executados. A condição previamente estabelecida para analisar o padrão em água ultrapura e metanol não se mostrou adequada para quantificar a toxina na matriz do extrato, já que houve co-eluição de interferentes junto à MC-LR. Sendo assim, eluições gradiente foram testadas, sendo estabelecida a condição em que a Fase A variou de 30% a 50% de 0 a 70 minutos como a que melhor separou ambos os picos. O método com eluição gradiente é linear para a faixa de concentrações testada, com um LD de 0,03 mg L-1 e um LQ de 0,09 mg L-1. Um dos extratos, denominado de extrato 2, não apresentou MC-LR, enquanto que os outros dois extratos (1 e 3) demonstraram possuir concentrações de 7,10 mg L-1 e 0,68 mg L-1 respectivamente.
Abstract: Cyanobacteria are microorganisms that, in certain environmental conditions, can produce and release different metabolites, such as cyanotoxins. One hepatotoxic cyanotoxin of great importance is microcystin-LR (MC-LR) that commonly appears in cyanobacterial blooms, mainly of Microcystis genera, with severe effects to the human body and animals if ingested. The detection of this metabolite in water is usually performed using chromatographic techniques, which require previous steps of optimization and validation of the chosen method. The objective of this study was to optimize and validate a chromatographic method for quantification of microcystin-LR, and also analyse a cyanobacterial extract containing the toxin by chromatography. As a consequence of the low sensitivity of the technique in detecting this compound, recovery tests of this analite using the solid phase extraction (SPE) technique were performed. The analysis were conducted in a high performance liquid chromatograph coupled with a diode array detector (HPLC-DAD) (Agilent – 1260 Infinity). Based on published data, the chosen method consisted of an isocratic elution using acetonitrile (ACN) with 0,05% of trifluoracetic acid (TFA) (phase A) and water with 0,05% TFA (phase B) as a mobile phase and a C18 chromatographic column (250 mm x 4,6 mm x 5 μm). The best conditions of analysis were established, including 238 nm for monitoring, 60:40 H2O:ACN for mobile phase proportion, 20 µL for injection volume, and 1,0 mL min-1 as flow rate. With the validation in ultra pure water, were established that the method is linear within the working range tested, with a limit of detection (LOD) of 0,06 mg L-1 and a limit of quantification (LOQ) of 0,17 mg L-1. A method for the concentration of microcystin-LR was also established, using the solid phase extraction technique, with CHROMABOND® C-18 end-capped cartridges, with recovery of 98,51% ± 2,74%. Tests of exctract samples obtained from a cyanobacterial culture, prepared in previous studies, were also performed. The previous established condition to analyse the standard in ultrapure water and methanol was not suitable to quantify the extract matrix toxin, due to co-elution of other compounds with the MC-LR. Therefore, gradient elutions were tested, being established 30:70 ACN:H2O until 50:50 ACN:H2O in 70 minutes as the best condition to separate the co-eluting peaks. The gradient elution method was linear for the concentration range tested, with LOD of 0,03 mg L- 1 and LOQ of 0,09 mg L-1. One of the extracts, called extract 2, didn’t show any sign of MCLR, while the other two extracts (1 and 3), showed concentrations of 7,10 mg L-1 and 0,68 mg L-1, respectively.
URI: http://repositorio.roca.utfpr.edu.br/jspui/handle/1/12045
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